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譜析分享:新型冠狀病毒感染的肺炎實(shí)驗(yàn)室儀器檢測(cè)技術(shù)指南

2020-01-29 10:18:22來源:admin
為指導(dǎo)各級(jí)疾控部門和其他相關(guān)機(jī)構(gòu)開展新型冠狀病毒感染的肺炎實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作,特制定本技術(shù)指南。本指南主要介紹目前已經(jīng)比較成熟、易于實(shí)施的核酸檢測(cè)方法。
                           
一、標(biāo)本采集
 
(一)采集對(duì)象。新型冠狀病毒感染的肺炎疑似病例、疑似聚集性病例患者,其他需要進(jìn)行新型冠狀病毒感染診斷或鑒別診斷者,或其他需要進(jìn)一步篩查檢測(cè)的環(huán)境或生物材料(如溯源分析)。
 
(二)標(biāo)本采集要求。
 
1.從事新型冠狀病毒檢測(cè)標(biāo)本采集的技術(shù)人員應(yīng)經(jīng)過生物安全培訓(xùn)(培訓(xùn)合格)和具備相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)技能。采樣人員專業(yè)防護(hù)裝備(personal protective equipment,PPE)要求:N95口罩、護(hù)目鏡、防護(hù)服、乳膠手套、防水靴套;如果接觸患者血液、體液、分泌物或排泄物時(shí),戴雙層乳膠手套。
 
2.住院病例的標(biāo)本由所在醫(yī)院醫(yī)護(hù)人員在當(dāng)?shù)丶部貦C(jī)構(gòu)專業(yè)人員指導(dǎo)下采集。
 
3.密切接觸者標(biāo)本由當(dāng)?shù)丶部貦C(jī)構(gòu)負(fù)責(zé)采集。
 
4.根據(jù)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作的需要,可結(jié)合病程多次采樣。
 
(三)標(biāo)本采集種類。每個(gè)病例必須采集急性期呼吸道標(biāo)本和急性期血液標(biāo)本;重癥病例優(yōu)先采集下呼吸道標(biāo)本(如支氣管或肺泡灌洗液等),可根據(jù)臨床表現(xiàn)與采樣時(shí)間間隔進(jìn)行采集。
 
其他研究材料依據(jù)設(shè)計(jì)需求采集。
 
標(biāo)本種類:
 
1.上呼吸道標(biāo)本:包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物。
 
2.下呼吸道標(biāo)本:包括深咳痰液、呼吸道抽取物、支氣管灌洗液、肺泡灌洗液、肺組織活檢標(biāo)本。
 
3.血液標(biāo)本:盡量釆集發(fā)病后7天內(nèi)的急性期抗凝血。采集量5ml,以空腹血為佳,建議使用含有抗凝劑的真空釆血管采集血液。
 
4.血清標(biāo)本:盡量釆集急性期、恢復(fù)期雙份血清。第一份血清應(yīng)盡早(最好在發(fā)病后7天內(nèi))釆集,第二份血清應(yīng)在發(fā)病后第3~4周釆集。采集量5ml,以空腹血為佳,建議使用真空釆血管。
 
(四)標(biāo)本采集方法。
 
1.咽拭子:用2根聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子同時(shí)擦拭雙側(cè)咽扁桃體及咽后壁,將拭子頭浸入含3ml采樣液的管中,尾部棄去,旋緊管蓋。
 
2.鼻拭子:將1根聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子輕輕插入鼻道內(nèi)鼻腭處,停留片刻后緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)退出。取另一根聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子以同樣的方法采集另一側(cè)鼻孔。上述兩根拭子浸入同一含3ml采樣液的管中,尾部棄去,旋緊管蓋。
 
3.鼻咽抽取物或呼吸道抽取物:用與負(fù)壓泵相連的收集器從鼻咽部抽取粘液或從氣管抽取呼吸道分泌物。將收集器頭部插入鼻腔或氣管,接通負(fù)壓,旋轉(zhuǎn)收集器頭部并緩慢退出,收集抽取的粘液,并用3ml采樣液沖洗收集器1次(亦可用小兒導(dǎo)尿管接在50ml注射器上來替代收集器)。
 
4.深咳痰液:要求病人深咳后,將咳出的痰液收集于含3ml采樣液的50ml螺口塑料管中。
 
5.支氣管灌洗液:將收集器頭部從鼻孔或氣管插口處插入氣管(約30cm深處),注入5ml生理鹽水,接通負(fù)壓,旋轉(zhuǎn)收集器頭部并緩慢退出。收集抽取的粘液,并用采樣液沖洗收集器1次(亦可用小兒導(dǎo)尿管接在50ml注射器上來替代收集)。
 
6.肺泡灌洗液:局部麻醉后將纖維支氣管鏡通過口或鼻經(jīng)過咽部插入右肺中葉或左肺舌段的支管,將其頂端契入支氣管分支開口,經(jīng)氣管活檢孔緩緩加入滅菌生理鹽水,每次30~50 ml,總量100~250 ml,不應(yīng)超過300 ml。
 
7.血液標(biāo)本:建議使用含有抗凝劑的真空釆血管采集血液標(biāo)本5ml,室溫靜置30分鐘,1500~2000rpm離心10分鐘,分別收集血漿和血液中細(xì)胞于無菌螺口塑料管中。
 
8.血清標(biāo)本:用真空負(fù)壓采血管采集血液標(biāo)本5ml,室溫靜置30分鐘,1500~2000rpm離心10分鐘,收集血清于無菌螺口塑料管中。
 
9.其他材料:依據(jù)設(shè)計(jì)需求規(guī)范采集。
 
(五)標(biāo)本包裝。標(biāo)本采集后在生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室生物安全柜內(nèi)分裝。
 
1.所有標(biāo)本應(yīng)放在大小適合的帶螺旋蓋內(nèi)有墊圈、耐冷凍的樣本采集管里,擰緊。容器外注明樣本編號(hào)、種類、姓名及采樣日期。
 
2.將密閉后的標(biāo)本放入大小合適的塑料袋內(nèi)密封,每袋裝一份標(biāo)本。
 
(六)標(biāo)本保存。用于病毒分離和核酸檢測(cè)的標(biāo)本應(yīng)盡快進(jìn)行檢測(cè),能在24小時(shí)內(nèi)檢測(cè)的標(biāo)本可置于4℃保存;24小時(shí)內(nèi)無法檢測(cè)的標(biāo)本則應(yīng)置于-70℃或以下保存(如無-70℃保存條件,則于-20℃冰箱暫存)。血清可在4℃存放3天,-20℃以下可長期保存。應(yīng)設(shè)立專庫或?qū)9駟为?dú)保存標(biāo)本。標(biāo)本運(yùn)送期間應(yīng)避免反復(fù)凍融。
 
(七)標(biāo)本送檢。標(biāo)本采集后應(yīng)盡快送往實(shí)驗(yàn)室,如果需要長途運(yùn)輸標(biāo)本,建議采用干冰等制冷方式進(jìn)行保藏。
 
1.上送標(biāo)本:各?。ㄗ灾螀^(qū)、直轄市)首例檢測(cè)結(jié)果陽性、疑似聚集性病例及聚集性病例的標(biāo)本,上送中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所進(jìn)行檢測(cè)復(fù)核,并附樣本送檢表(見附件)。
 
2.病原體及標(biāo)本運(yùn)輸
 
2.1 國內(nèi)運(yùn)輸
 
新型冠狀病毒毒株或其他潛在感染性生物材料的運(yùn)輸包裝分類屬于A類,對(duì)應(yīng)的聯(lián)合國編號(hào)為UN2814,包裝符合國際民航組織文件Doc9284《危險(xiǎn)品航空安全運(yùn)輸技術(shù)細(xì)則》的PI602分類包裝要求;環(huán)境樣本屬于B類,對(duì)應(yīng)的聯(lián)合國編號(hào)為UN3373,包裝符合國際民航組織文件Doc9284《危險(xiǎn)品航空安全運(yùn)輸技術(shù)細(xì)則》的PI650分類包裝要求;通過其他交通工具運(yùn)輸?shù)目蓞⒄找陨蠘?biāo)準(zhǔn)包裝。
 
新型冠狀病毒毒株或其他潛在感染性材料運(yùn)輸應(yīng)按照《可感染人類的高致病性病原微生物菌(毒)種或樣本運(yùn)輸管理規(guī)定》(原衛(wèi)生部令第45號(hào))辦理《準(zhǔn)運(yùn)證書》。
 
2.2 國際運(yùn)輸
 
新型冠狀病毒毒株或樣本在國際間運(yùn)輸?shù)?,?yīng)規(guī)范包裝,按照《出入境特殊物品衛(wèi)生檢疫管理規(guī)定》辦理相關(guān)手續(xù),并滿足相關(guān)國家和國際相關(guān)要求。
  
二、新型冠狀病毒的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)
 
新型冠狀病毒感染的常規(guī)檢測(cè)方法是通過實(shí)時(shí)熒光RT-PCR鑒定。任何新型冠狀病毒的檢測(cè)都必須在具備適當(dāng)條件的實(shí)驗(yàn)室由經(jīng)過相關(guān)技術(shù)安全培訓(xùn)的人員進(jìn)行操作。本指南中的核酸檢測(cè)方法主要針對(duì)新型冠狀病毒基因組中開放讀碼框1a/b(open reading frame 1ab,ORF1ab)和核殼蛋白(nucleocapsid protein,N)。
 
在實(shí)驗(yàn)室要確認(rèn)一個(gè)病例為陽性,滿足以下條件:
 
同一份標(biāo)本中新型冠狀病毒2個(gè)靶標(biāo)(ORF1ab、N)特異性實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)結(jié)果均為陽性。
 
陰性結(jié)果也不能排除新型冠狀病毒感染,需要排除可能產(chǎn)生假陰性的因素,包括:樣本質(zhì)量差,比如口咽等部位的呼吸道樣本;樣本收集的過早或過晚;沒有正確的保存、運(yùn)輸和處理樣本;技術(shù)本身存在的原因,如病毒變異、PCR抑制等。
     
 
三、實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法檢測(cè)新型冠狀病毒核酸
 
(一)目的。規(guī)范實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法檢測(cè)新型冠狀病毒核酸的工作程序,保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的正確可靠。
 
(二)范圍。適用于實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法檢測(cè)新型冠狀病毒核酸。
 
(三)職責(zé)。
 
檢測(cè)人員:負(fù)責(zé)按照本檢測(cè)細(xì)則對(duì)被檢樣本進(jìn)行檢測(cè)。
 
復(fù)核人員:負(fù)責(zé)對(duì)檢測(cè)操作是否規(guī)范以及檢測(cè)結(jié)果是否準(zhǔn)確進(jìn)行復(fù)核。
 
部門負(fù)責(zé)人:負(fù)責(zé)對(duì)科室綜合管理和檢測(cè)報(bào)告的審核。
 
(四)樣本接收和準(zhǔn)備。核對(duì)被檢樣本姓名、性別、年齡、編號(hào)及檢測(cè)項(xiàng)目等;待檢樣本的狀態(tài)如有異常,需注明;待檢樣本應(yīng)存放于-70℃冰箱保存。
 
(五)檢測(cè)項(xiàng)目。
 
1.新型冠狀病毒核酸測(cè)定(實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法)
 
推薦選用針對(duì)新型冠狀病毒的ORF1ab、N基因區(qū)域的引物和探針。
 
靶標(biāo)一(ORF1ab):
 
正向引物(F):CCCTGTGGGTTTTACACTTAA
 
反向引物(R):ACGATTGTGCATCAGCTGA
 
熒光探針(P):5'-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3'
 
靶標(biāo)二(N):
 
正向引物(F):GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT
 
反向引物(R):CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG
 
熒光探針(P):5'-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3'
 
核酸提取和實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)體系參考相關(guān)廠家試劑盒說明。
 
2.結(jié)果判斷
 
陰性:無Ct值或Ct值>40。
 
陽性:Ct值<37,可報(bào)告為陽性。
 
可疑:Ct值在37-40之間,建議重復(fù)實(shí)驗(yàn),若Ct值<40,擴(kuò)增曲線有明顯起峰,該樣本判斷為陽性,否則為陰性。
 
四、病原生物安全實(shí)驗(yàn)活動(dòng)要求
 
根據(jù)目前掌握的新型冠狀病毒的生物學(xué)性狀、傳播特性、致病性、臨床資料等信息,考慮到新型冠狀病毒感染聚集性發(fā)病且有重癥病例,并有死亡病例的特點(diǎn),實(shí)驗(yàn)活動(dòng)暫按照病原微生物危害程度分類中第二類病原微生物進(jìn)行管理,具體要求如下:
 
(一)病毒培養(yǎng)。指病毒的分離、培養(yǎng)、滴定、中和試驗(yàn)、活病毒及其蛋白純化、病毒凍干以及產(chǎn)生活病毒的重組試驗(yàn)等操作。利用活病毒或其感染細(xì)胞(或細(xì)胞提取物),不經(jīng)滅活進(jìn)行的生化分析、血清學(xué)檢測(cè)、免疫學(xué)檢測(cè)等操作視同病毒培養(yǎng),上述操作應(yīng)在具有開展相應(yīng)活動(dòng)資質(zhì)的生物安全三級(jí)(Biological Safety Level 3,BSL-3)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。使用病毒培養(yǎng)物提取核酸時(shí),裂解劑或滅活劑的加入必須在與病毒培養(yǎng)同等級(jí)別實(shí)驗(yàn)室和防護(hù)條件下進(jìn)行,可靠方法滅活后的病毒培養(yǎng)物,可在BSL-2或BSL-1級(jí)實(shí)驗(yàn)室操作。
 
(二)動(dòng)物感染實(shí)驗(yàn)
 
指以活病毒感染動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)。應(yīng)在具有開展相應(yīng)活動(dòng)資質(zhì)的動(dòng)物(animal)BSL-3(ABSL-3)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行操作。
 
(三)未經(jīng)培養(yǎng)的感染性材料的操作
 
未經(jīng)培養(yǎng)的感染性材料在采用可靠的方法滅活前進(jìn)行的病毒抗原檢測(cè)、血清學(xué)檢測(cè)、核酸檢測(cè)、生化分析等操作,應(yīng)在生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室操作,但個(gè)人防護(hù)裝備參照生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室的防護(hù)要求。未經(jīng)可靠滅活或固定的人和動(dòng)物組織標(biāo)本因含病毒量較高,其操作的防護(hù)級(jí)別應(yīng)比照病毒培養(yǎng)。
 
(四)滅活材料的操作
 
感染性材料或活病毒在采用可靠的方法滅活后可在BSL-1實(shí)驗(yàn)室操作。
 
(五)無感染性材料的操作
 
指針對(duì)確認(rèn)無感染性的材料的各種操作,包括但不限于無感染性的病毒DNA或cDNA操作,應(yīng)在BSL-1實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

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